湖北鹽業(yè)集團(tuán)有限公司武漢分公司

摘要：菌落總數(shù)作為判定化妝品被污染的程度標(biāo)志，關(guān)系到產(chǎn)品的衛(wèi)生質(zhì)量及使用的安全性，本文針對(duì)膏狀浴鹽菌落總數(shù)的測(cè)定進(jìn)行詳述，并對(duì)今后化妝品菌落總數(shù)的檢測(cè)方法及方向進(jìn)行探討和展望。

        關(guān)鍵詞：膏狀浴鹽    菌落總數(shù)    測(cè)定    方法探討

        微生物的世界變化莫測(cè)、令人著迷，它無(wú)處不在，存在于我們生活的每一個(gè)角落，存在于產(chǎn)品生產(chǎn)的每一道工序中。由于膏狀浴鹽在生產(chǎn)過(guò)程中是先制成膠體、加鹽后再制成膏體的，膠體系統(tǒng)有時(shí)會(huì)受到微生物的污染和降解，膏體系統(tǒng)偶爾也會(huì)有耐鹽菌存活，污染源包括原材料、制作過(guò)程、設(shè)備和操作人員等；產(chǎn)品包裝的設(shè)計(jì)在膏狀浴鹽微生物污染中舉足輕重，其中廣口容器最易受到污染；膏狀浴鹽的水分較粉狀浴鹽多，更易支持微生物的生長(zhǎng)……由于浴鹽成品本身是不再滅菌的，并且其生產(chǎn)原料通常也是不滅菌的，只是在生產(chǎn)中通過(guò)溶解原料時(shí)加溫和半成品存放中照射紫外線來(lái)殺菌，因此，我們不可能100%地清除浴鹽生產(chǎn)原料、設(shè)備、環(huán)境和操作過(guò)程中的微生物。只能通過(guò)質(zhì)控和檢測(cè)來(lái)減少微生物進(jìn)入到產(chǎn)品中，將其控制在一個(gè)對(duì)生產(chǎn)和對(duì)消費(fèi)者相對(duì)安全的水平。

        一、檢測(cè)目的

        微生物是影響化妝品衛(wèi)生安全的重要指標(biāo)，也是產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量合格與否的重要標(biāo)志。根據(jù)權(quán)威檢驗(yàn)部門(mén)的結(jié)論及多年來(lái)化妝品檢測(cè)的數(shù)據(jù)分析：化妝品微生物檢測(cè)指標(biāo)中合格率較低的項(xiàng)目主要是菌落總數(shù)，其次為霉菌和糞大腸菌群，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌只是在個(gè)別化妝品中才會(huì)檢出。絕大多數(shù)化妝品微生物不合格的原因是菌落總數(shù)超標(biāo)，而較少或根本檢測(cè)不出腸道細(xì)菌、真菌或致病菌。由此可見(jiàn)，影響化妝品質(zhì)量的主要微生物指標(biāo)是菌落總數(shù)，但同時(shí)它與其它菌之間存在著一定的關(guān)聯(lián)?；瘖y品中菌落總數(shù)越多，糞大腸菌群、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的檢出率也越高；反之，如果在某一樣品中檢出金黃色葡萄球菌、糞大腸菌群和銅綠假單胞菌，那么該樣品的菌落總數(shù)肯定會(huì)超過(guò)國(guó)標(biāo)的相關(guān)規(guī)定。
        隨著人們對(duì)化妝品要求的不斷提高，化妝品廠家在生產(chǎn)中增添了多種動(dòng)植物原料和營(yíng)養(yǎng)成份，為細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造了良好的條件。雖然沐浴鹽的主要成分是鹽，鹽具有殺菌消炎的功效，但在膏狀浴鹽配方設(shè)計(jì)過(guò)程中考慮到鹽顆粒在膠體中懸浮的均勻性以及使用時(shí)泡沫是否豐富等因素會(huì)將鹽含量限制在一個(gè)合適的范圍中。只是沐浴鹽與其它沐浴液相比，微生物生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)非常小甚至沒(méi)有，但不能保證產(chǎn)品一定是無(wú)菌的，需要通過(guò)成品微生物檢測(cè)來(lái)判定。為及時(shí)掌握膏狀浴鹽在生產(chǎn)過(guò)程中的衛(wèi)生質(zhì)量與衛(wèi)生安全，了解和核查生產(chǎn)中所選用原料、生產(chǎn)設(shè)備、工藝流程及操作人員的衛(wèi)生狀況，判定產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中被微生物——細(xì)菌污染的程度，我們建議采用標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法與TTC瓊脂培養(yǎng)基法相結(jié)合來(lái)進(jìn)行菌落總數(shù)的測(cè)定，以此作為改進(jìn)生產(chǎn)工藝及判定成品衛(wèi)生質(zhì)量是否合格的依據(jù)。

         二、菌落總數(shù)的定義及檢測(cè)原理

        菌落的英文是（colony），定義為細(xì)菌和其它幾種微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖而形成的能被肉眼識(shí)別的生長(zhǎng)物，它是由數(shù)以萬(wàn)計(jì)的相同細(xì)菌聚集而成的，故又有細(xì)菌集落之稱(chēng)。各種細(xì)菌的菌落各自具有一定的特征，按其特征的不同可以在某種程度上鑒別某種細(xì)菌，為微生物檢驗(yàn)提供依據(jù)。菌落總數(shù)系指檢樣經(jīng)過(guò)外包裝清潔消毒，樣品稱(chēng)量、稀釋等處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH 值、需氧性質(zhì)等），分裂生長(zhǎng)成一個(gè)個(gè)肉眼或低倍顯微鏡下可見(jiàn)的細(xì)菌集落，并通過(guò)平皿計(jì)數(shù)，1g（或1ml）檢樣中所含菌落的總數(shù)。其培養(yǎng)的原理是指檢樣在被稀釋到一定濃度后，吸取一定量的檢樣，檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞和培養(yǎng)基均勻混合后，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞都形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的菌落的假設(shè)為基礎(chǔ)的。由于各種化妝品中被污染的細(xì)菌種類(lèi)不同，如浴鹽中會(huì)存在由海水或井下鹵水帶來(lái)的極少量的嗜鹽菌、表面活性劑原料中偶爾夾帶的枯草芽孢桿菌等，每種細(xì)菌都有它一定的生理活性，培養(yǎng)時(shí)對(duì)培養(yǎng)要求，如溫度、時(shí)間等有所不同，而在實(shí)際檢驗(yàn)工作中，不可能滿足所有菌的培養(yǎng)條件，因此所測(cè)定的結(jié)果只包括在本方法規(guī)定的條件下（在卵磷脂、吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，于37℃培養(yǎng)48小時(shí)）生長(zhǎng)的一群嗜中溫的需氧性菌落總數(shù)。厭氧或微需氧菌、有特殊營(yíng)養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細(xì)菌，在該條件下難以繁殖生長(zhǎng)。即實(shí)際存在的菌落數(shù)大于檢測(cè)出來(lái)的菌落總數(shù)。菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類(lèi)，有時(shí)也被稱(chēng)為雜菌數(shù)、需氧菌數(shù)等。

        三、檢測(cè)方法

        菌落總數(shù)的測(cè)定是將被檢樣品制成幾個(gè)不同的10倍遞增稀釋液，然后從每個(gè)稀釋液中分別取出1ml置于滅菌平皿中與TTC—卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，在一定溫度下，培養(yǎng)一定時(shí)間后（一般為48小時(shí)），記錄每個(gè)平皿中形成的菌落數(shù)量，并依據(jù)稀釋倍數(shù)，計(jì)算出每克（或每ml）原始樣品中所含有的細(xì)菌菌落總數(shù)。檢驗(yàn)方法參見(jiàn)2007年版《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》。由于規(guī)范中的檢測(cè)方法是針對(duì)所有化妝品的，故本文在規(guī)范方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合膏狀浴鹽的產(chǎn)品特性及檢測(cè)的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，對(duì)其菌落總數(shù)的測(cè)定進(jìn)行了補(bǔ)充和注解，以供鹽行業(yè)內(nèi)浴鹽微生物檢測(cè)人員交流參考。
        基本操作一般包括：樣品采集和制備－－稀釋?zhuān)瓋A注平皿－－培養(yǎng)48小時(shí)－－計(jì)數(shù)報(bào)告。
        （一）儀器和試劑
         1.儀器
        250ml三角瓶、200ml量筒、15×150mm試管、直徑 9cm滅菌平皿、10ml、2ml和1ml滅菌刻度吸管、酒精燈、放大鏡、pH 計(jì)或精密 pH 試紙、高壓滅菌器、36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱。
         2.試劑
         （1）滅菌蒸餾水
         成分：   蒸餾水            1000mL
         制法：將蒸餾水分裝到加玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)，每瓶                90ml，103kPa（121℃  15 lb）下高壓滅菌20min。
         （2）卵磷脂吐溫80—營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基
         成分：蛋白胨                 20.0g
         牛肉浸出粉或膏           3.0g
         氯化鈉                          5.0g
         瓊脂                             15.0g
         卵磷脂                         1.0g
         吐溫80                        7.0g
        目前該培養(yǎng)基市上有售，不需要自行配制，購(gòu)買(mǎi)時(shí)應(yīng)選擇技術(shù)力量強(qiáng)、通過(guò)質(zhì)管體系認(rèn)證的企業(yè)產(chǎn)品，培養(yǎng)基品牌要相對(duì)固定，不要經(jīng)常更換廠家，以避免試驗(yàn)中因使用不同廠商的產(chǎn)品所造成的誤差，影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于培養(yǎng)基的原材料不同，品牌生產(chǎn)商使用的原料蛋白胨質(zhì)量較好、顏色偏淺，制出的培養(yǎng)基透明度高，菌落易分辨，個(gè)別廠商生產(chǎn)的培養(yǎng)基雜質(zhì)較多，菌落與雜質(zhì)較難分辨。建議到杭州華東醫(yī)藥股份有限公司或杭州微生物試劑有限公司等正規(guī)渠道購(gòu)買(mǎi)。
        使用方法：取本品51g于1000ml蒸餾水中，加熱、攪拌至溶解，經(jīng)121℃、20min滅菌后，冷卻至45—50℃時(shí)，傾注平皿備用（具體參照培養(yǎng)基上的使用說(shuō)明）
       0.5％氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride，TTC）
        成分：        TTC             0.5g
        蒸餾水                          100ml
        制法：溶解后過(guò)濾，103.43kPa（121℃  15 lb）20min 高壓滅菌，裝于棕色試劑瓶?jī)?nèi)，置4℃中冰箱備用。
       （二）樣品的采集及制備
         1.供檢樣品的采集
        （1）所采集的樣品，應(yīng)具有代表性，一般視每批浴鹽數(shù)量的大小，根據(jù)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中的檢驗(yàn)規(guī)則抽取相應(yīng)數(shù)量的包裝單位。由于膏狀浴鹽呈膏體粘稠形態(tài)，灌裝前成品取樣時(shí)不應(yīng)集中一點(diǎn)，宜多采幾個(gè)部位。
       （2）待檢的浴鹽，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)，軟管、塑料罐等包裝不應(yīng)有破損，檢驗(yàn)前不得打開(kāi)，防止樣品被污染。若包裝表面有污染，檢驗(yàn)前應(yīng)用酒精棉花擦拭干凈。
        （3）接到樣品后，應(yīng)立即登記，編寫(xiě)檢驗(yàn)序號(hào)，并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)。如不能及時(shí)檢驗(yàn)，樣品應(yīng)存放在室溫陰涼、干燥處，不需冷藏或冷凍。
        （4）特殊情況下，若只有一個(gè)樣品而同時(shí)需做多種檢驗(yàn)，如細(xì)菌、重金屬、理化等，則應(yīng)先取出部分樣品做細(xì)菌檢驗(yàn)，再將剩余樣品做其它分析。
        （5）操作中必須有“無(wú)菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的，不得殘留有細(xì)菌或抑菌物質(zhì)。所用剪刀、鑷子等器具也必須進(jìn)行消毒處理。如果是出廠檢驗(yàn)，應(yīng)用75%酒精在包裝開(kāi)口處擦拭后取樣。全部操作應(yīng)在超凈工作臺(tái)或經(jīng)過(guò)滅菌處理的無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行。
         2.供檢樣品的制備
        稱(chēng)取10g樣品，加到裝有玻璃珠和90ml蒸餾水并已滅菌的錐形瓶中，充分振蕩混勻（如有均質(zhì)器，均質(zhì)1~2min效果更好），靜置15min。取其上清液作為1:10的檢液。若樣品過(guò)于粘稠，可稱(chēng)取25g樣品加到裝有225ml蒸餾水和玻璃珠并已滅菌的錐形瓶中，以加大樣品量來(lái)提高檢樣的代表性。
        3.樣品的稀釋
       （1）稀釋液：樣品稀釋液一般是滅菌生理鹽水，但對(duì)含鹽量較高的膏狀浴鹽進(jìn)行稀釋時(shí)，可采用滅菌蒸餾水，以防檢樣稀釋液氯化鈉濃度過(guò)高抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)。在每支15×150mm試管中吸入9ml蒸餾水，制作數(shù)量根據(jù)樣品的多少及稀釋倍數(shù)而定，滅菌待用。
       （2）用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌蒸餾水的試管內(nèi)，振搖試管混合均勻，制成1：100的稀釋液，注意吸管進(jìn)出三角瓶或試管時(shí)，吸管口不觸及瓶口、管口的外圍部分。另取1ml滅菌吸管，按上述操作順序，制成10倍遞增稀釋液，以此類(lèi)推。平行樣重復(fù)此操作。
       （3）為減少樣品的稀釋誤差，在進(jìn)行連續(xù)遞增稀釋時(shí)，每一稀釋液應(yīng)充分振搖，使其均勻，同時(shí)每一稀釋度應(yīng)更換一支吸管，應(yīng)將吸管內(nèi)液體沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀釋液內(nèi)，以免吸管外部粘附的檢液溶于其內(nèi)。
         4.傾注培養(yǎng)
        （1）根據(jù)樣品被污染的情況估計(jì)，選擇2—3個(gè)適宜的稀釋度，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿（平行樣），吸取1ml選定稀釋度的稀釋液于滅菌平皿中。由于膏狀浴鹽含鹽量較高，從以往的經(jīng)驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)來(lái)看，選擇1/10和1/100的稀釋度比較合適，但如果在浴鹽中添加了較多的天然植物或中草藥成分的話，選擇1/100和1/1000的稀釋度比較適宜。
        （2）待檢用的培養(yǎng)基應(yīng)在45-50℃水浴內(nèi)保溫，傾注時(shí)培養(yǎng)基溫度過(guò)高會(huì)燙死部分不耐高溫的細(xì)菌，使菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果偏低；過(guò)低瓊脂易凝固結(jié)塊而不能與檢液充分混勻，且培養(yǎng)后的平皿不易計(jì)數(shù)。如無(wú)水浴，應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜。
        （3）將融化并冷卻至45-50℃的卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi)，傾注量在12ml—20ml之間，以每皿約15ml為宜，培養(yǎng)基過(guò)厚會(huì)影響觀察計(jì)數(shù)，太薄又易于干裂。傾注時(shí)，培養(yǎng)基底部若有沉淀物，應(yīng)將底部棄去，避免過(guò)多的雜質(zhì)與菌落混淆而影響計(jì)數(shù)觀察。
       （4）為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并輕輕地水平晃動(dòng)平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻。檢樣從開(kāi)始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜太長(zhǎng)，一般不超過(guò)20min，以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。
        （5）分別將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液（滅菌蒸餾水）的滅菌平皿內(nèi)作稀釋液空白對(duì)照、傾入不加樣品的滅菌空平皿內(nèi)作培養(yǎng)基空白對(duì)照、傾入敞開(kāi)放置于無(wú)菌室操作臺(tái)上的滅菌空平皿作空氣空白對(duì)照。培養(yǎng)基空白對(duì)照可以避免培基中的雜質(zhì)與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆、不易分辨的情況，以便計(jì)數(shù)時(shí)作對(duì)照觀察?？諝猓ōh(huán)境）空白對(duì)照可以每年檢驗(yàn)2—3次，采用操作臺(tái)面上對(duì)角線五點(diǎn)檢測(cè)，而稀釋液和培養(yǎng)基空白對(duì)照最好每次都做。
        （6）待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置 36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48h±2h，取出計(jì)算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。
       （7）培養(yǎng)時(shí)間規(guī)范上要求48h±2h，根據(jù)多次觀察，由于膏狀浴鹽含有一定量的鹽分，檢出的菌落總數(shù)較少，一般1/10只有個(gè)位數(shù)，1/100幾乎沒(méi)有。在生產(chǎn)銷(xiāo)售緊急的情況下，通過(guò)24h的培養(yǎng)也可以計(jì)數(shù)，只是培養(yǎng)48h后，菌落個(gè)頭變得更大更明顯而已，此時(shí)計(jì)數(shù)不易發(fā)生差錯(cuò)，但在正常情況下應(yīng)按規(guī)范上要求的時(shí)間培養(yǎng)。
       （8）為便于區(qū)別浴鹽中的顆粒與菌落，可在每100ml卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加入1ml0.5%的TTC溶液，如有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色，而浴鹽的顆粒顏色則無(wú)變化。
       （9）培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)基失重不應(yīng)超過(guò)15％。
         5.計(jì)數(shù)報(bào)告
        培養(yǎng)到時(shí)間后，點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)。先用肉眼觀察，必要時(shí)用放大5～10倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后，求出同一稀釋度各平皿生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，計(jì)算出原始樣品中每克（或每ml）中的菌落數(shù)，進(jìn)行報(bào)告。
       （1）到達(dá)規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間后，應(yīng)立即計(jì)數(shù)。如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于0－4℃環(huán)境中，但不得超過(guò)24h。
       （2）計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)選取菌落數(shù)在30～300之間的平皿，作為菌落總數(shù)計(jì)數(shù)的依據(jù)。 若有二個(gè)稀釋度均在30～300之間時(shí)，則按規(guī)范要求以二者之比值決定，若比值小于或等于2則取平均數(shù)，比值大于2則報(bào)告其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)報(bào)告之。
       （3）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在計(jì)數(shù)區(qū)間，如均大于300個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之；如均小于30個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。如菌落數(shù)有的大于300個(gè)，而有的又小于30個(gè)，均不在30～300個(gè)之間，則以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。若所有的稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則應(yīng)按每g或每ml小于10CFU報(bào)告之。
       （4）不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個(gè)平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近），即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗(yàn)中的差錯(cuò)（膏狀浴鹽有時(shí)會(huì)出現(xiàn)逆反現(xiàn)象），不應(yīng)作為檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù)。若空白對(duì)照平板出現(xiàn)菌落，則此次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。
        （5）當(dāng)平皿上有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，如呈鏈狀生長(zhǎng)的菌落之間無(wú)任何明顯界限，則應(yīng)作為一個(gè)菌落計(jì)，如存在幾條不同來(lái)源的鏈，則每條鏈應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算，不應(yīng)把鏈上生長(zhǎng)的每一個(gè)菌落分開(kāi)計(jì)數(shù)。如有連成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，該平皿不宜計(jì)數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘以2，以代表全皿菌落數(shù)。
        （6）當(dāng)計(jì)數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過(guò)多（即所有稀釋度均大于300時(shí)），但分布又很均勻，則可取平板的一半或1/4計(jì)數(shù)，再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。
        （7）菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告，菌落數(shù)在 10 以?xún)?nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)值報(bào)告之，大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五入法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面零的個(gè)數(shù)，可用10的指數(shù)來(lái)表示。在報(bào)告菌落數(shù)為“不可計(jì)”時(shí)，應(yīng)注明樣品的稀釋度。
       （8）菌落的形成單位CFU，CFU是cotong forming units的英文縮寫(xiě)，意思是菌落形成單位數(shù)，鑒于化妝品檢樣的細(xì)菌細(xì)胞是以單個(gè)、成雙、鏈狀、葡萄狀、成片花點(diǎn)樣或成堆的形式存在，因而在營(yíng)養(yǎng)瓊脂出現(xiàn)的菌落可以來(lái)源一個(gè)細(xì)胞群，也可以是一個(gè)單個(gè)細(xì)胞，因此平板計(jì)數(shù)不報(bào)告準(zhǔn)確的活菌個(gè)數(shù)，而是以單位重量、體積或表面積內(nèi)形成單位數(shù)(CFU)報(bào)告，CFU／g(m1)表示每克或每毫升樣品中含有多少個(gè)菌落形成單位。

         四、檢驗(yàn)方法探討

        目前我國(guó)對(duì)化妝品規(guī)定一律按《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2007年版）進(jìn)行檢驗(yàn)，它較以前的《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2002年版）和《GB 7918.2化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》（1987年版）有明顯的改進(jìn)。它的實(shí)施，對(duì)于進(jìn)一步規(guī)范化妝品原料、生產(chǎn)、檢驗(yàn)和包裝具有非常重要的指導(dǎo)意義，但是由于《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》適用于所有的化妝品，其中有一些細(xì)節(jié)問(wèn)題還需要補(bǔ)充和完善，探討如下：
        （一）菌落總數(shù)空白對(duì)照的改進(jìn)
         《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中5.2要求的空白對(duì)照主要為培養(yǎng)基空白對(duì)照，該空白對(duì)照上如果沒(méi)有菌落生長(zhǎng),說(shuō)明檢測(cè)過(guò)程所用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿等用具的滅菌情況和檢驗(yàn)的操作過(guò)程符合無(wú)菌要求；但如果有2個(gè)以上菌落生長(zhǎng)，則需追加空白對(duì)照平皿進(jìn)行培養(yǎng)觀察，以鑒別和判定到底是培養(yǎng)基還是培養(yǎng)皿、吸管等器具可能存在的污染，如有可能則在消除污染之后重新檢測(cè)。為減少誤差，建議在檢測(cè)過(guò)程中：1）將培養(yǎng)基空白對(duì)照由1個(gè)增至2個(gè)，使空白對(duì)照的數(shù)量與檢樣每個(gè)稀釋度測(cè)定的平皿數(shù)量( 均為2 個(gè)平皿)一致,這樣可以更好地反映無(wú)樣品時(shí)的細(xì)菌數(shù)量、反映器具和培養(yǎng)基的滅菌情況以及無(wú)菌操作情況；2）每次檢測(cè)樣品時(shí)增加稀釋液的平行空白對(duì)照，從而判斷稀釋液和試管的的滅菌情況；3）根據(jù)無(wú)菌室的滅菌情況，每年進(jìn)行數(shù)次環(huán)境檢測(cè)，利于發(fā)現(xiàn)環(huán)境（空氣）和檢驗(yàn)環(huán)節(jié)中存在的問(wèn)題，進(jìn)而更加準(zhǔn)確地測(cè)定樣品的菌落總數(shù)。
        （二）中和檢液的pH值
         由于化妝品在生產(chǎn)過(guò)程中使用的一些原材料呈酸或堿性，所以最終產(chǎn)品可能偏酸或堿性。雖然多數(shù)生產(chǎn)廠家在成品前會(huì)將產(chǎn)品的pH值調(diào)至中性，但也有一些企業(yè)在產(chǎn)品中增添了一些功能性特殊原料，而這些原材料的功效必須在酸或堿性的環(huán)境中才能顯現(xiàn)出來(lái)，因此，建議做菌落總數(shù)時(shí)，先測(cè)一下原液或稀釋后檢液的pH值，若原液很粘稠，無(wú)法直接測(cè)定pH值，可用1/10檢液測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其偏酸或堿時(shí)，在原液或稀釋后的檢液植入平皿前將其調(diào)成中性，調(diào)中性的酸堿一般使用弱酸或弱堿，如冰醋酸或純堿的稀釋液等，否則在太酸或堿的培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)菌是無(wú)法生長(zhǎng)的，這樣做會(huì)利于企業(yè)出廠檢驗(yàn)的控制。盡管一些酵母和霉菌可耐受酸性環(huán)境（pH<4），但一般細(xì)菌生長(zhǎng)的pH值是在中性范圍中，許多化妝品中的細(xì)菌都受到其不利pH值的抑制，如pH<4或pH>10。但隨著pH值逐漸遠(yuǎn)離中性，細(xì)菌在其中的生長(zhǎng)能力也逐漸減弱，在具有極端pH值的酸或堿環(huán)境中，很難發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長(zhǎng)。
       （三）減少稀釋引起的誤差
        在檢驗(yàn)中，由于化妝品中含有防腐劑、消毒劑及某些修復(fù)成分等，抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng), 會(huì)造成不同稀釋度檢出的菌落總數(shù)異?，F(xiàn)象，而稀釋后，滅菌生理鹽水或滅菌蒸餾水等稀釋液緩解了防腐劑、消毒劑的作用，細(xì)菌的生存環(huán)境有了一定的改善, 使細(xì)菌開(kāi)始生長(zhǎng)繁殖，出現(xiàn)了樣品在第一稀釋度無(wú)菌生長(zhǎng)，而第二或第三稀釋度有細(xì)菌生長(zhǎng)（即稀釋度高的菌落數(shù)反而比稀釋度低的多）的情況。出現(xiàn)這種現(xiàn)象主要是防腐劑等化學(xué)物質(zhì)，抑制了樣品中細(xì)菌的生長(zhǎng)。在稀釋度高時(shí)，防腐劑的濃度低；稀釋度低時(shí)，防腐劑濃度高，從而造成菌落總數(shù)的逆反現(xiàn)象，針對(duì)這種情況：1.可使用抗干擾微生物培養(yǎng)基，其可分為抗防腐劑型、抗消毒劑型和抗臭氧型等。但抗干擾微生物培養(yǎng)基的價(jià)格通常比普通培養(yǎng)基貴，且要有針對(duì)性地使用，否則會(huì)無(wú)效，并造成另外的干擾。2.視樣品不同，不能一概使用滅菌生理鹽水或滅菌蒸餾水作稀釋液, 應(yīng)在稀釋液配制中加入適量的能中和防腐劑或抑菌劑的物質(zhì)，以減少稀釋帶來(lái)的誤差。
       （四）提高細(xì)菌總數(shù)的檢出率
        細(xì)菌種類(lèi)繁多，每種細(xì)菌都有它一定的生理特性和培養(yǎng)要求，而在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，我們不可能做到滿足所有菌的要求，只包括在一定的條件下（在卵磷脂、吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，于37℃培養(yǎng)48小時(shí)）生長(zhǎng)的一群嗜中溫的需氧及兼性厭氧的細(xì)菌菌落總數(shù)。而實(shí)際上在所檢樣品中可能不止存在這些細(xì)菌。當(dāng)我們?cè)谧鲈囼?yàn)研究或想檢出更多的菌種時(shí)，我們就要配制一種營(yíng)養(yǎng)成分更全面、更豐富而又極易被大多數(shù)微生物吸收利用的培養(yǎng)基。研究資料顯示，使用美國(guó)食品藥品管理局(FDA)的標(biāo)準(zhǔn)平板培養(yǎng)基(即每1000 ml培養(yǎng)基含胰蛋白胨5g、酵母膏2.5g、葡萄糖1g、瓊脂 15g)測(cè)定細(xì)菌總數(shù)，比我們現(xiàn)在國(guó)內(nèi)使用的卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂（即每1000ml培養(yǎng)基含蛋白胨10g、牛肉膏3g、Nacl5g、瓊脂15g）平均檢出率高23.9%；另一種方法就是對(duì)卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行改進(jìn)，在原來(lái)成分的基礎(chǔ)上分別添加0.1%葡萄糖和0.1%酵母膏，原因是該培養(yǎng)基沒(méi)有提供初始純碳源。培養(yǎng)基中的碳源、氮源均來(lái)自牛肉膏和蛋白胨，而葡萄糖是一種絕大多數(shù)細(xì)菌最易吸收利用的良好碳源，添加0.1%葡萄糖作為碳源對(duì)絕大多數(shù)細(xì)菌的初始生長(zhǎng)是極為有利的。酵母膏營(yíng)養(yǎng)豐富，除提供大量B族維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等碳源、氮源外，還提供礦物質(zhì)以及谷胱甘肽、酶類(lèi)、核酸等具有生理活性作用的營(yíng)養(yǎng)成分，添加0.1%的酵母膏利于絕大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)。
       （五）測(cè)定方法展望
        隨著微生物學(xué)和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了許多關(guān)于菌落總數(shù)測(cè)定的新技術(shù)和新方法，目前化妝品菌落總數(shù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法是平板計(jì)數(shù)法，其優(yōu)點(diǎn)是能較好地反映菌落的疏密程度，重復(fù)性和平行性較好，可獲得活菌菌落信息，是經(jīng)典的計(jì)數(shù)方法，缺點(diǎn)是培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，需要配制培養(yǎng)基和清洗、消毒培養(yǎng)器皿等大量輔助性工作，操作過(guò)程繁瑣。相對(duì)于食品的直接入口而言，化妝品涂抹、噴灑于人體表面的特性，危害性要略小一些，但在生產(chǎn)任務(wù)緊急的情況下，產(chǎn)品需要當(dāng)天出貨，采用規(guī)范的檢測(cè)方法48小時(shí)獲得的檢測(cè)結(jié)果實(shí)際意義有限。由此，快速檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，并由培養(yǎng)水平向分子水平邁進(jìn)。目前主要應(yīng)用于食品但也有部分應(yīng)用在化妝品領(lǐng)域內(nèi)的快速檢測(cè)技術(shù)有：1.生物電化學(xué)方法：常見(jiàn)的有阻抗分析法、伏安分析法、電位電流分析法等；2.ATP生物發(fā)光法；3.濾膜法；4.量熱法；5.流式細(xì)胞術(shù)；6.顯微圖像識(shí)別技術(shù)；7.固相細(xì)胞計(jì)數(shù)法；8.機(jī)器視覺(jué)法等。菌落總數(shù)是目前國(guó)內(nèi)最常用的微生物檢測(cè)項(xiàng)目，能否在最短的時(shí)間內(nèi)快捷、準(zhǔn)確地反映樣品的微生物數(shù)量，是我們微生物檢測(cè)人員今后努力的工作方向，特別是近年來(lái)隨著分子生物學(xué)、微電子技術(shù)及生物技術(shù)的發(fā)展，微生物快速檢驗(yàn)技術(shù)已有了很大的突破，今后我們的方法標(biāo)準(zhǔn)一定會(huì)更加便捷、準(zhǔn)確、合理、全面！

【參考文獻(xiàn)】：
[1] 衛(wèi)生部. 化妝品衛(wèi)生規(guī)范[S]. 北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社, 2007.1.
[2] 王艷萍，趙虎山. 化妝品微生物學(xué)[M]. 北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2002. 50-55.
[3] 劉堅(jiān)真，陳國(guó)壽，李海波，周海濤，梁艷彥，張文明，黃鐵銘. GB 4789.2-1994 關(guān)于測(cè)定食品細(xì)菌總數(shù)培養(yǎng)基技術(shù)改進(jìn)研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2001，28（2）：63-68.
[4] 熊海燕. 菌落總數(shù)檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 糧食與油脂，2010，（4）：42-44.
[5] 魏國(guó)美. 國(guó)內(nèi)食品菌落總數(shù)測(cè)定方法研究[J]. 福建分析測(cè)試，2008，17（4）：32-35.